NMR

La Resonancia Magnética Nuclear (NMR) es una técnica espectroscópica que se puede utilizar para obtener propiedades estructurales y dinámicas de las moléculas explotando el comportamiento de ciertos átomos cuando se colocan en imanes superconductores muy potentes (180 000 a 360 000 veces más fuertes que el campo magnético de la tierra para imanes en UConn Health). Cuando los núcleos activos de RMN se colocan en un campo magnético fuerte, sus núcleos se alinean con el campo y comienzan a procesarse a una frecuencia que depende de la relación giromagnética de los isótopos y la fuerza del campo magnético aplicado, junto con el entorno químico y físico del átomo. El componente de la frecuencia que depende del entorno químico y físico se denomina desplazamiento químico. Los experimentos de NMR perturban la alineación aplicando pulsos cortos de energía de radiofrecuencia (RF) para determinar el desplazamiento químico de cada uno de los átomos activos de NMR en la molécula que se está estudiando. Mediante el uso de combinaciones de pulsos y retardos (esto se conoce como una secuencia de pulsos), se puede determinar la información adicional tal como qué átomos están unidos entre sí, y qué átomos están espacialmente cerca uno del otro. Mediante el uso de muchos experimentos diferentes es posible determinar la estructura tridimensional de las moléculas, incluyendo grandes bio-moléculas como proteínas.

Las investigaciones de NMR de alta resolución son más factibles para proteínas de menos de 25 kDa en masa y solubles alrededor de 0,5 mM. En ciertos casos puede ser posible investigar proteínas o complejos de mayor tamaño o menor solubilidad. Las proteínas de membrana son difíciles de estudiar utilizando métodos de alta resolución, pero están surgiendo nuevas técnicas que pueden ser aplicables. Debido a que los estudios de NMR suelen requerir etiquetado, la proteína con isótopos estables 15N, 13C y a veces 2H (un sistema de expresión adecuado para el crecimiento en medios etiquetados), debe estar disponible. Las proteínas deben purificarse (normalmente se requiere el <95%), plegadas y, al menos, marginalmente estables. Se recomienda la caracterización preliminar mediante dicroísmo circular y desnaturalización térmica o de disolvente.

Esta pregunta es difícil de responder, ya que depende de las preguntas que se formulan y del comportamiento de la muestra. Normalmente se necesitan 300 µl (con tubos de RMN especializados) a 600 µl de muestra. Las concentraciones de proteínas para sistemas de buen comportamiento deben ser superiores a 150 µM para estudios estructurales, pero se pueden utilizar concentraciones más bajas para otros estudios no estructurales. Si bien 150 µM es una estimación aproximada de la concentración más baja a utilizar para estudios estructurales, es aconsejable lograr que las concentraciones de proteínas sean lo más altas posible y deben estar limitadas por la solubilidad y el comportamiento proteico, no por la cantidad de proteína preparada. La cantidad de tiempo utilizado para ejecutar experimentos más largos para compensar las bajas concentraciones, y el aumento del tiempo para interpretar los espectros de NMR, casi con seguridad será más largo que el tiempo que se tarda en preparar una muestra adicional.

Una vez que la muestra ha sido suficientemente purificada y secada, el siguiente paso consiste en elegir un disolvente adecuado. Dado que el deuterio es, con mucho, el núcleo de bloqueo más popular, la muestra se disuelve generalmente en un disolvente deuterado (un disolvente deuterado es aquel en el que una gran proporción, normalmente más del 99%, de los átomos de hidrógeno ha sido reemplazada por deuterio). Los disolventes deuterados de uso común son acetona-d6, benceno-d6 y cloroformo-d, aunque hay muchos otros disolventes disponibles.

Los factores a tener en cuenta a la hora de elegir un disolvente son:

1. Solubilidad:

• Cuanto más soluble sea la muestra, mejor. Esto maximiza la cantidad de muestra dentro del volumen sensible, lo que aumenta la sensibilidad del experimento. La alta solubilidad es particularmente importante si sólo se dispone de pequeñas cantidades de muestra.

2. Interferencia de señales de disolvente con el espectro de muestras

• El disolvente en sí producirá inevitablemente señales de NMR que oscurecerán las regiones del espectro. Estos «picos residuales de disolvente» no deben superponerse con las señales de la muestra.

3. Dependencia de temperatura:

• Para experimentos por encima o por debajo de la temperatura ambiente, los disolventes que se funden y hierven también son factores importantes. Además, es probable que la solubilidad de la muestra varíe con la temperatura.

4. Viscosidad:

• Cuanto menor sea la viscosidad del disolvente, mejor será la resolución del experimento.

5. Coste:

• Obviamente, para la NMR de rutina, donde muchas muestras necesitan ser medidas, el costo del disolvente es una consideración importante. Como regla general, el precio aumenta con el número de átomos deuterados.

6. Contenido de agua:

• Prácticamente todos los disolventes NMR contienen trazas de agua. También muchos son higroscópicos (absorben el agua de la atmósfera) y, por lo tanto, cuanto más tiempo se almacenan, más agua contienen. La presencia de un pico de agua (HDO) sólo servirá para degradar la calidad de los espectros de NMR. El nivel de agua en el disolvente se puede reducir en gran medida mediante la filtración a través de un agente de secado o mediante el almacenamiento del disolvente sobre tamices moleculares.
• La elección de disolvente para una muestra en particular representará el mejor equilibrio entre las diversas ventajas e inconvenientes de cada uno. Para obtener detalles precisos de disolventes específicos, consulte el texto estándar de NMR.